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离子交换层析介质的原理和应用-相关知识-离子交换柱,离子柱,磷酸盐加药装置,宜兴市鹰鹏水处理设备有限公司
离子交换层析介质的原理和应用
已阅:2528  2015-6-6
 

离子交换层析分离纯化生物大分子的过程,主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography 简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

1.离子交换层析的基本原理:
离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法,也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。

离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离,具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。

由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前,在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。

2.离子交换层析介质:

离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。

阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换,而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来,从而达到分离目的。

各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的,是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关,包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异,并通过改变离子强度、pH 等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲,离子价数越高,结合力越大;价数相同时,原子序数越高,结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为:

Li+Na+ K+ Rb+ Cs+ Na+ Ca2+ Al3+ Ti4+

蛋白质等生物大分子通常呈两性,它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH 有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例,在一定的pH 条件下,等电点pI < pH 的蛋白带负电,不能与阳离子交换剂结合;等电点pI > pH 的蛋白带正电,能与阳离子交换剂结合,一般pI 越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响,一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计,往往要通过实验进行摸索。

3.离子交换层析介质的种类和性质:

3.1离子交换剂的基质:

离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成,苯乙烯系离子交换剂是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。苯乙烯系离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小,具有较强的疏水性,容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质,如无机离子、氨基酸、核苷酸等。以纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力,适合于分离蛋白质等大分子物质

3.2离子交换剂的电荷基团:

根据与基质共价结合的电荷基团的性质,可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电,可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同,又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH 范围,强酸型离子交换剂在较大的pH 范围内电荷基团完全解离,而弱酸型完全解离的pH 范围则较小,如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团,如磺酸甲基、磺酸乙基等为强酸型离子交换剂,结合磷酸基团和亚磷酸基团为中等酸型离子交换剂,结合酚羟基或羧基,如羧甲基为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H 离子的结合力比Na+离子小,弱酸型离子交换剂对H 离子的结合力比Na+离子大。

阴离子交换剂的电荷基团带正电,可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同,可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团,如季胺乙基为强碱型离子交换剂,结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或弱碱型离子交换剂,如结合二乙基氨基乙基为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子小,弱酸型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子大。

3.3交换容量:

交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量,它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量,又称为总交换容量,它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量,它不仅与所用的离子交换剂有关,还与实验条件有很大的关系,一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。

影响交换容量的因素很多,主要可以分为两个方面,一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入,这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品,可以选择较小孔隙的交换剂,因为小分子可以自由的进入孔隙,而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品,可以选择小颗粒交换剂,因为对于很大的分子,一般不能进入孔隙内部,交换只限于颗粒表面,而小颗粒的离子交换剂表面积大。

另一些影响因素如实验中的离子强度、pH 值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH 对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大,如对于弱酸型离子交换剂在pH 较高时,电荷基团充分解离,交换容量大,而在较低的pH 时,电荷基团不易解离,交换容量小。同时pH 也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质,在离子交换层析中要选择合适的pH 以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说,离子强度增大,交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱,就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数(mmol/gmmol/mL)来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl 处理,使其平衡离子为H+。再用水洗至中性,对于强酸型离子交换剂,用NaCl 充分置换出H+,再用标准浓度的NaOH 滴定生成的HCl,就可以计算出离子交换剂的交换容量;对于弱酸型离子交换剂,用一定量的碱将H+充分置换出来,再用酸滴定,计算出离子交换剂消耗的碱量,就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。

对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示,一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。

 

1.离子交换剂的选择

在进行分离纯化时,要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点,其中分离介质是最主要的影响因素,因此,分离介质的选择尤为重要。

1.1品种的选择:

应根据被分离纯化目标产物所带电荷的种类、分子的大小、物理化学性质及所处的微环境等因素,选择适宜的离子交换层析介质。对于无机小分子而言,分离介质的选择相对容易,但对于生物大分子就必须考虑更多的因素。

蛋白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的,在不同的pH条件下显示不同的电性,而生物大分子对最适宜的pH环境具有特定的要求,因此,必须首先了解目标蛋白的等电点及适宜的微环境,根据这些条件选择合适的离子交换剂种类。

是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂,主要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷,如果带正电,则选择阳离子交换剂;如带负电,则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4,稳定的pH 范围为6~9,由于这时蛋白带负电,故应选择阴离子交换剂进行分离。

1.2骨架的选择:

应根据目标产品的产量、要求达到的纯度及经济价值等因素,选择合适骨架(基质)的离子交换剂。

通用型的聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点,适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有效成分等一般生化制品的提取分离工艺。而对于要求分辨率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品,仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化分离专用介质。

纤维素离子交换剂价格较低,但分辨率和稳定性都较低,适于初步分离和大量制备葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中,但受外界影响较大,体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变,影响分辨率琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好,分辨率也较高,但价格较贵

理想的分离介质应该不但易于吸附,还要易于洗脱,如果目标产物对于离子强度和pH值的变化不敏感,可以考虑采用高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。如果对这些因素比较敏感,则应采用弱酸性或弱碱性的弱型介质。如果大分子物质被吸附后,结合比较牢固,往往难以洗脱,采用苛刻的条件又容易引起大分子的变性,则应选用功能基团密度低的介质。

强酸性或强碱性的强型介质,适用的pH 范围广,常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离,但由于电性较强,有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质,其选择性有较大的范围,且不易使蛋白质失活,故一般适用于分离蛋白质等大分子物质,但其适用的pH范围较窄。

1.3粒径的选择:

分离介质粒径的大小对离子交换层析柱的分辨率和流速有明显的影响。一般来说分离介质的粒径小,分辨率高,但平衡离子的平衡时间长,流速慢;粒径大则柱的流速较快,压降小,但分辨率低,负载量也较小。所以大颗粒的分离介质适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离,而小颗粒的分离介质适合于需要高分辨率的精细分离或产品的精制阶段。

2.操作中注意事项

2.1预处理:

在离子交换剂的工业产品中,常含有少量的有机低聚物及一些无机杂质,在使用初期会逐渐溶解释放,影响目标产品的质量。因此,工业级离子交换剂在使用前必须进行预处理。

通用型的离子交换树脂通常使用酸、碱进行处理,可采用1~2 mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液,以4~6倍树脂床体积交替进行处理,在酸及碱处理之间须用去离子水洗至中性。对于大孔型的树脂,还需要用乙醇、丙酮等有机溶剂进行处理,以除去生产过程中所用的有机物残余物。对分离介质进行预处理,不但能提高其工作容量,更可提高被分离产品的纯度。经预处理后的树脂,最后应转为分离过程中适用的离子型态。

对于生化专用的离子交换剂,以多糖类骨架为主的介质,一般贮存在20%的乙醇中。为了分离介质在分离过程中尽量减少pH值的变化,需要用大量的去离子水进行清洗,然后用缓冲液进行平衡。

分离介质的预处理可以在柱内进行,也可以在烧杯等容器中进行。在柱内进行预处理时,或溶液体系改变及操作温度变化时,经常会出现气泡,尤其在使用内径较小的柱时。气泡一经出现,必须及时清除,否则对层析工艺有明显的影响。

2.2缓冲液平衡介质:

pH值是离子交换层析的操作中的一个重要因素,而pH的稳定及改变通常是用缓冲液来实现的,所以缓冲液的选择是影响分离效果的重要因素。

在选择缓冲液时,pH和离子强度是两个关键性的因素,它不仅影响到分离介质对目标产物与杂质的分离效果,而且还影响到产品的收率。选用的pH值取决于目标产物的等电点、稳定性和溶解度,不但要使被分离的物质成为可以进行交换的离子,还要维持其较高的活性。同时也应该考虑到离子交换剂的pK值。

由于缓冲液本身带电,所以也会与离子交换层析介质结合。这种结合将带来两方面的干扰,一方面降低缓冲液的浓度,进而降低了缓冲能力;另一方面是与分离介质进行交换,从而与蛋白质竞争介质的交换容量。因此,在使用阴离子交换层析介质时,要避免采用磷酸盐之类的带负电的缓冲液,在使用阳离子交换层析介质时,则要避免采用Tris之类的带正电的缓冲液。由于分离介质的种类不同,起始过程也略有不同,在通常情况下,使用阴离子交换层析介质时,起始缓冲液要高于目标蛋白等电点0.5 ~ 1 pH值;使用阳离子交换层析介质时,则起始缓冲液要低于目标蛋白等电点0.5 ~ 1 pH值。

2.3层析柱的操作:

2.3.1操作方式:

由于生化分离的样品、缓冲液和洗脱液都是流动相,可在流经柱时进行分离,因此,离子交换可以采用柱式操作,以层析形式进行分离。在分离过程中,未被吸附的物质不断流出反应体系,使平衡不断右移,是一种动态平衡,所以也称为动态操作。动态操作方式分离效果好,适用于各类样品,可实现连续操作。在层析分离的操作中,层析柱的装填情况对分离有一定的影响,介质在柱内要分布均匀,尤其不允许气泡的存在,也应防止介质产生分层现象。

对于一些粘度较大的样品,进行初步提取分离时,也可以采用静态处理方法,经离子交换剂与需处理的工作液在反应容器中进行搅拌,当达到吸附平衡后,将介质与残液分离,装入柱中进行洗脱。这种静态分批操作的方法,工艺设备简单,操作简便,如肝素钠等一些天然产物的初步分离,往往采用这种静态分离方式。在静态分离方式的操作中,应适当控制离子交换剂在工作液中的搅拌速度,若搅拌速度过快,剪切力过大,会造成离子交换颗粒的破碎,难以进行过滤分离;但若搅拌速度过慢,则影响介质与工作液的接触,也影响交换速率。

2.3.2柱式操作的种类:

固定床分离:在柱式操作中,料液作为流动相,在柱内自上而下地流动,在流动的过程中进行吸附。为了得到较好的分离效果,对分离柱有三点最基本的要求:分离柱底部要有孔径分布均匀的筛板,以防止流动相产生偏流;分离柱支持层下端的死角体积要尽量地小,以防止分离过程中色谱带混合或扩展;无论大小,分离柱都必须保持垂直。在固定床操作中,可以进行正向洗脱,也可以进行逆向洗脱,一般情况下,逆向洗脱或再生可获得较好的效果,但对操作有较为严格的要求。

流态床:流动的料液从柱的下端流入,从上端流出,分离介质在柱内呈流态状。此种分离方法对操作有严格的要求,一般较少应用,洗脱方式以采用正向洗脱为好。

2.3.3工作液对分离效果的影响:

为了使生化分离达到高分辨率及高负载量,工作液的制备及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影响离子交换剂的分离效果,还影响到分离介质的使用寿命。生化分离往往是一个比较复杂的体系,其中有多种杂质存在,不但有简单的小分子,还有一些胶体物质、脂类物质等,尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆盖了介质的功能基团,或堵塞了介质的孔道,造成不可逆污染,缩短分离介质的使用寿命。因此,在分离操作前,应尽量将工作液进行适当的预处理,以确保分离的效果。

在生化分离纯化过程中,由于淋洗过程带走了一些目标产物,或因洗脱不完全而使目标产物滞留在介质上,造成产物的损失,是影响产品收率的重要因素,同时,蛋白质的结构变化引起失活,也将影响活化收率。在离子交换过程中加入一些稳定剂或保护剂,不但可以提高收率,还可提高分离介质对蛋白质的选择性。

2.3.4流速对分离效果的影响:

离子交换层析分离中,流速是影响分离效果的一个重要因素。为了获取优良的分离效果,应根据离子交换剂的种类、粒径、工作液中有效成分的分子结构等因素,进行试验,以确立较佳的试验参数。若目标产物的分子量相对比较小,且介质的孔径比较大时,因为有利于传质作用,可采用较高的流速。而对于目标产物为生物大分子,且介质的孔径相对于被分离物质分子较小时,由于分子的扩散速率较慢,则宜采用较慢的流速。在工作液的粘度较大时,因传质速率较低,也应采用较低的流速。

流速不但影响交换吸附的效果,也影响洗脱的效果,通常情况下,洗脱时的流速要比交换吸附时慢些。

2.4介质的洗脱、再生方式:

当离子交换剂失效后,应进行洗脱,其基本原理是用一种比吸着物质更活泼的离子或基团,把交换吸附到介质颗粒外表面和内部的目标产物解吸下来。吸着物不同,其活泼性不同,因此,应选择合适的洗脱剂,将蛋白质从介质上洗脱下来,收集分离纯化的产物。

离子交换层析大致有三种洗脱方式:

一种为同步洗脱。洗脱剂是同一种物质,可采用稀的酸、碱或盐类溶液,也可选用适当的有机溶剂,其中以盐溶液为主,依据目标产物的性质及最终得到产物的剂型进行选择。由于被吸着的物质往往不是单一的品种,各种物质所带的电荷电量不同,与介质的结合强度不同,即使使用同一种洗脱剂,容易被替换的物质先脱离介质流出,结合力较强的物质后流出,只要通过分级收集,就可以把各种物质分离,得到较纯净的产物。这种方法多用于对目标产物的性能了解很清楚时的分离,或用于分析类的分离。

第二种为分步洗脱,即分别用不同浓度的盐溶液进行洗脱。分离介质在交换吸附过程中,会有多种蛋白质被吸附,如果采用一个恒定的洗脱条件,有时不能将所有的组分适当地分开,需要改变洗脱条件。可以是阶段式的改变,即选用不同的洗脱剂或不同pH值的洗脱剂分阶段进行洗脱,可以根据洗脱液不同的浓度、不同的酸度得到不同的洗脱峰。即一种盐浓度可以得到一种目标蛋白,不同的盐浓度可以得到不同的目标蛋白。这种分步洗脱的方式,适用于已知性质蛋白的分离,尤其适用于规模生产中,操作方便,易于控制。

第三种为连续的梯度洗脱,即按一定的线性变化改变洗脱液的离子强度或pH值(一般只在特殊情况下使用改变pH值的洗脱方式),在洗脱剂渐变的过程中,将不同的蛋白质逐一置换,可得到各种不同的蛋白组分,同时,蛋白质一般不拖尾。梯度洗脱是离子交换层析中最常用的洗脱方式,也是洗脱能力相对最强的洗脱方式,适合于对电荷性质相近组分的洗脱。

在洗脱过程中,顺流洗脱或逆流洗脱均可采用,顺流洗脱也称为正向洗脱,即洗脱液的流动方向与工作液的流动方向相同,逆流洗脱也称为反向洗脱,即洗脱液的流动方向与工作液的流动方向相反。若料液是自上而下正向通过交换柱进行交换吸附的,则交换柱上层吸附物的浓度要比下层高,洗脱液自下而上反向解吸可以更高效地达到洗脱的目的。但由于逆向洗脱的操作要比正向洗脱复杂得多,故目前多以正向洗脱为主。

洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离的效果,洗脱速度通常要保持恒定。一般来说,慢速洗脱的分辨率要比快速洗脱好,但洗脱速度过慢,会造成分离时间长,样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用,所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中于某个区域造成重叠,则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率。如果分辨率较好,但洗脱峰过宽,则应适当提高洗脱速度。

2.5介质的消毒:

在某些纯度要求较高的生化产品制备过程中,往往要求对分离介质进行消毒处理,以防止微生物等杂质混入目标产品中。

采用高温消毒是最常用的方法,目前大多数离子交换剂具有稳定的物理化学性能,均可进行高温消毒处理。但在使用多糖类介质时,必须注意,介质一定要处于盐型,而且要在中性条件下才能进行高温消毒处理,否则将会导致多糖大分子骨架的降解,严重影响介质的使用寿命。

NaOH也是一种很好的消毒剂,但要根据介质的耐碱程度和微生物污染的种类、污染程度选用合适浓度的NaOH。这种消毒方法也可以采用柱内浸泡法,即将一定浓度的NaOH通入柱中,关闭出液阀,浸泡几个小时后,可达到消毒的目的。NaOH如果与乙醇合用,可以得到更佳的效果。用NaOH消毒还可将消毒和在位清洗合并处理。

2.6介质的复苏

在生化分离过程中,由于分离体系较为复杂,含有多种蛋白质或其他杂质,因此在使用过程中常出现树脂的中毒现象。中毒原因可能是由于大分子的多点带电,与介质进行多点结合,致使难以洗脱,使介质的有效功能基团减少。也可能是一些较大的分子被卡牢在孔道内,难以扩散出来,堵塞了孔道,在以后的交换过程中影响到颗粒内功能基团的有效工作。除生物大分子外,色素及腐殖酸等都可使介质中毒。有时工作液中的胶状物质被粘附于介质颗粒的内外表面,覆盖了功能基团,这也是影响介质工作容量的重要因素。

由于上述原因,离子交换层析介质在使用一段时间后,可能出现颜色变深、床体收缩、分辨率下降、蛋白质收率降低、反压升高等现象。此时,需要对介质进行净化处理。对于介质用量比较大,自动化程度比较高的规模生产,应采用在原交换柱内进行,即在位清洗。先从交换柱的下面通过适量的清水,目的是去除交换柱中的悬浮物,并将床体疏松,还可以将结块的介质分散,有利于以后介质与清洗液的接触。对于一般的污染,采用逆流清洗,可减少污染物对下层介质的污染。应根据介质种类及污染程度的不同,分别选用不同种类的清洗剂及不同的清洗步骤。一般的介质是用2mol/LNaCl1mol/LNaOH0.1mol/LHCl1mol/LHCl溶液交替分阶段清洗或浸泡,各试剂交替之间须用去离子水洗至中性。若经过上述处理后仍无明显改善,尤其是流速无明显提高,则要检查交换柱布水器的纱网是否出现堵塞。

上述过程即为通常所说的复苏过程。不同的介质应选用不同的复苏方法,主要取决于介质的物理化学性能及污染物质的性质。对于多糖类的离子交换剂,每当使用一段时间后,可采用离子浓度较大的缓冲液通过交换柱或浸泡介质,因为缓冲液的离子强度较大时,有利于蛋白质大分子脱离介质,达到复苏的效果。对于物化结构稳定的介质,也可使用NaCl溶液通过交换柱或浸泡介质。对于物化结构非常稳定的介质,可用30℃~40℃的乙醇或丙酮进行洗脱或浸泡,在高温下可使吸附在介质上的蛋白变性或加快扩散速度,也有利于胶体物质的破坏,从而使污染物脱离介质。还可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl,更有利于介质的复苏。

清除沉淀蛋白、脂类、疏水性的蛋白及脂蛋白,处理步骤更为复杂。可采用100%的异丙醇、20%的乙腈、2mol/LNaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的盐酸胍、阳离子或非离子洗涤剂等作为处理液。在用过这些清洗剂后,都要用至少2倍体积的蒸馏水进行清洗。使用有机溶剂后,交换柱要采用锯齿形的梯度洗涤进行清洗,即可以在5倍床体积内,使溶剂的含量从0增至100%,然后在下一个5倍床体积中,使溶剂的含量从100%降到0

如果经过上述处理,交换柱的工作情况仍没有恢复,可以使用蛋白水解酶,将仍滞留在介质内的蛋白质进行水解,使其脱离介质。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L NaCl溶液注入到交换柱中,在室温下浸泡过夜,或在37℃下浸泡一小时。根据污染物的情况,也可以采用DNA酶等其它的酶类。无论使用哪一种酶处理后,都要重复上述清除污染物的清洗步骤,把酶清洗干净。

脂蛋白对分离介质的污染比较严重,因为脂蛋白及其它脂类物质,很容易粘附在层析柱内,最好在进行分离工艺前先将其去除。推荐使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀剂,可去除高含量的脂蛋白。

2.6介质的贮存:

各种分离介质在使用后都要进行清洗后再贮存,这对于多糖类分离介质尤为重要。分离介质在使用后,先用2个床体积的清水清洗,然后用2个床体积的20%的乙醇过柱。对于SP强酸性阳离子介质,要用含有0.2mol/L乙酸钠的20%乙醇溶液清洗,再用脱气的乙醇-水溶液以较慢的流速清洗。经过处理后,可在室温下贮存,或在4~8℃下长期存放。贮存过程中必须将层析柱全部封闭,以防止水分的挥发,造成干柱。暂时不用的介质必须贮存在20%的乙醇溶液中。所有的离子交换分离介质,都要在4℃~30℃的条件下贮存,并防止冷冻。

离子交换层析分离纯化生物大分子的过程,主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。

1.离子交换剂的选择

在进行分离纯化时,要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点,其中分离介质是最主要的影响因素,因此,分离介质的选择尤为重要。

1.1品种的选择:

应根据被分离纯化目标产物所带电荷的种类、分子的大小、物理化学性质及所处的微环境等因素,选择适宜的离子交换层析介质。对于无机小分子而言,分离介质的选择相对容易,但对于生物大分子就必须考虑更多的因素。

蛋白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的,在不同的pH条件下显示不同的电性,而生物大分子对最适宜的pH环境具有特定的要求,因此,必须首先了解目标蛋白的等电点及适宜的微环境,根据这些条件选择合适的离子交换剂种类。

是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂,主要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷,如果带正电,则选择阳离子交换剂;如带负电,则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4,稳定的pH 范围为6~9,由于这时蛋白带负电,故应选择阴离子交换剂进行分离。

1.2骨架的选择:

应根据目标产品的产量、要求达到的纯度及经济价值等因素,选择合适骨架(基质)的离子交换剂。

通用型的聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点,适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有效成分等一般生化制品的提取分离工艺。而对于要求分辨率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品,仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化分离专用介质。

纤维素离子交换剂价格较低,但分辨率和稳定性都较低,适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中,但受外界影响较大,体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变,影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好,分辨率也较高,但价格较贵。

理想的分离介质应该不但易于吸附,还要易于洗脱,如果目标产物对于离子强度和pH值的变化不敏感,可以考虑采用高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。如果对这些因素比较敏感,则应采用弱酸性或弱碱性的弱型介质。如果大分子物质被吸附后,结合比较牢固,往往难以洗脱,采用苛刻的条件又容易引起大分子的变性,则应选用功能基团密度低的介质。

强酸性或强碱性的强型介质,适用的pH 范围广,常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离,但由于电性较强,有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质,其选择性有较大的范围,且不易使蛋白质失活,故一般适用于分离蛋白质等大分子物质,但其适用的pH范围较窄。

1.3粒径的选择:

分离介质粒径的大小对离子交换层析柱的分辨率和流速有明显的影响。一般来说分离介质的粒径小,分辨率高,但平衡离子的平衡时间长,流速慢;粒径大则柱的流速较快,压降小,但分辨率低,负载量也较小。所以大颗粒的分离介质适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离,而小颗粒的分离介质适合于需要高分辨率的精细分离或产品的精制阶段。

2.操作中注意事项

2.1预处理:

在离子交换剂的工业产品中,常含有少量的有机低聚物及一些无机杂质,在使用初期会逐渐溶解释放,影响目标产品的质量。因此,工业级离子交换剂在使用前必须进行预处理。

通用型的离子交换树脂通常使用酸、碱进行处理,可采用1~2 mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液,以4~6倍树脂床体积交替进行处理,在酸及碱处理之间须用去离子水洗至中性。对于大孔型的树脂,还需要用乙醇、丙酮等有机溶剂进行处理,以除去生产过程中所用的有机物残余物。对分离介质进行预处理,不但能提高其工作容量,更可提高被分离产品的纯度。经预处理后的树脂,最后应转为分离过程中适用的离子型态。

对于生化专用的离子交换剂,以多糖类骨架为主的介质,一般贮存在20%的乙醇中。为了分离介质在分离过程中尽量减少pH值的变化,需要用大量的去离子水进行清洗,然后用缓冲液进行平衡。

分离介质的预处理可以在柱内进行,也可以在烧杯等容器中进行。在柱内进行预处理时,或溶液体系改变及操作温度变化时,经常会出现气泡,尤其在使用内径较小的柱时。气泡一经出现,必须及时清除,否则对层析工艺有明显的影响。

2.2缓冲液平衡介质:

pH值是离子交换层析的操作中的一个重要因素,而pH的稳定及改变通常是用缓冲液来实现的,所以缓冲液的选择是影响分离效果的重要因素。

在选择缓冲液时,pH和离子强度是两个关键性的因素,它不仅影响到分离介质对目标产物与杂质的分离效果,而且还影响到产品的收率。选用的pH值取决于目标产物的等电点、稳定性和溶解度,不但要使被分离的物质成为可以进行交换的离子,还要维持其较高的活性。同时也应该考虑到离子交换剂的pK值。

由于缓冲液本身带电,所以也会与离子交换层析介质结合。这种结合将带来两方面的干扰,一方面降低缓冲液的浓度,进而降低了缓冲能力;另一方面是与分离介质进行交换,从而与蛋白质竞争介质的交换容量。因此,在使用阴离子交换层析介质时,要避免采用磷酸盐之类的带负电的缓冲液,在使用阳离子交换层析介质时,则要避免采用Tris之类的带正电的缓冲液。由于分离介质的种类不同,起始过程也略有不同,在通常情况下,使用阴离子交换层析介质时,起始缓冲液要高于目标蛋白等电点0.5 ~ 1 pH值;使用阳离子交换层析介质时,则起始缓冲液要低于目标蛋白等电点0.5 ~ 1 pH值。

2.3层析柱的操作:

2.3.1操作方式:

由于生化分离的样品、缓冲液和洗脱液都是流动相,可在流经柱时进行分离,因此,离子交换可以采用柱式操作,以层析形式进行分离。在分离过程中,未被吸附的物质不断流出反应体系,使平衡不断右移,是一种动态平衡,所以也称为动态操作。动态操作方式分离效果好,适用于各类样品,可实现连续操作。在层析分离的操作中,层析柱的装填情况对分离有一定的影响,介质在柱内要分布均匀,尤其不允许气泡的存在,也应防止介质产生分层现象。

对于一些粘度较大的样品,进行初步提取分离时,也可以采用静态处理方法,经离子交换剂与需处理的工作液在反应容器中进行搅拌,当达到吸附平衡后,将介质与残液分离,装入柱中进行洗脱。这种静态分批操作的方法,工艺设备简单,操作简便,如肝素钠等一些天然产物的初步分离,往往采用这种静态分离方式。在静态分离方式的操作中,应适当控制离子交换剂在工作液中的搅拌速度,若搅拌速度过快,剪切力过大,会造成离子交换颗粒的破碎,难以进行过滤分离;但若搅拌速度过慢,则影响介质与工作液的接触,也影响交换速率。

2.3.2柱式操作的种类:

固定床分离:在柱式操作中,料液作为流动相,在柱内自上而下地流动,在流动的过程中进行吸附。为了得到较好的分离效果,对分离柱有三点最基本的要求:分离柱底部要有孔径分布均匀的筛板,以防止流动相产生偏流;分离柱支持层下端的死角体积要尽量地小,以防止分离过程中色谱带混合或扩展;无论大小,分离柱都必须保持垂直。在固定床操作中,可以进行正向洗脱,也可以进行逆向洗脱,一般情况下,逆向洗脱或再生可获得较好的效果,但对操作有较为严格的要求。

流态床:流动的料液从柱的下端流入,从上端流出,分离介质在柱内呈流态状。此种分离方法对操作有严格的要求,一般较少应用,洗脱方式以采用正向洗脱为好。

2.3.3工作液对分离效果的影响:

为了使生化分离达到高分辨率及高负载量,工作液的制备及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影响离子交换剂的分离效果,还影响到分离介质的使用寿命。生化分离往往是一个比较复杂的体系,其中有多种杂质存在,不但有简单的小分子,还有一些胶体物质、脂类物质等,尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆盖了介质的功能基团,或堵塞了介质的孔道,造成不可逆污染,缩短分离介质的使用寿命。因此,在分离操作前,应尽量将工作液进行适当的预处理,以确保分离的效果。

在生化分离纯化过程中,由于淋洗过程带走了一些目标产物,或因洗脱不完全而使目标产物滞留在介质上,造成产物的损失,是影响产品收率的重要因素,同时,蛋白质的结构变化引起失活,也将影响活化收率。在离子交换过程中加入一些稳定剂或保护剂,不但可以提高收率,还可提高分离介质对蛋白质的选择性。

2.3.4流速对分离效果的影响:

离子交换层析分离中,流速是影响分离效果的一个重要因素。为了获取优良的分离效果,应根据离子交换剂的种类、粒径、工作液中有效成分的分子结构等因素,进行试验,以确立较佳的试验参数。若目标产物的分子量相对比较小,且介质的孔径比较大时,因为有利于传质作用,可采用较高的流速。而对于目标产物为生物大分子,且介质的孔径相对于被分离物质分子较小时,由于分子的扩散速率较慢,则宜采用较慢的流速。在工作液的粘度较大时,因传质速率较低,也应采用较低的流速。

流速不但影响交换吸附的效果,也影响洗脱的效果,通常情况下,洗脱时的流速要比交换吸附时慢些。

2.4介质的洗脱、再生方式:

当离子交换剂失效后,应进行洗脱,其基本原理是用一种比吸着物质更活泼的离子或基团,把交换吸附到介质颗粒外表面和内部的目标产物解吸下来。吸着物不同,其活泼性不同,因此,应选择合适的洗脱剂,将蛋白质从介质上洗脱下来,收集分离纯化的产物。

离子交换层析大致有三种洗脱方式:

一种为同步洗脱。洗脱剂是同一种物质,可采用稀的酸、碱或盐类溶液,也可选用适当的有机溶剂,其中以盐溶液为主,依据目标产物的性质及最终得到产物的剂型进行选择。由于被吸着的物质往往不是单一的品种,各种物质所带的电荷电量不同,与介质的结合强度不同,即使使用同一种洗脱剂,容易被替换的物质先脱离介质流出,结合力较强的物质后流出,只要通过分级收集,就可以把各种物质分离,得到较纯净的产物。这种方法多用于对目标产物的性能了解很清楚时的分离,或用于分析类的分离。

第二种为分步洗脱,即分别用不同浓度的盐溶液进行洗脱。分离介质在交换吸附过程中,会有多种蛋白质被吸附,如果采用一个恒定的洗脱条件,有时不能将所有的组分适当地分开,需要改变洗脱条件。可以是阶段式的改变,即选用不同的洗脱剂或不同pH值的洗脱剂分阶段进行洗脱,可以根据洗脱液不同的浓度、不同的酸度得到不同的洗脱峰。即一种盐浓度可以得到一种目标蛋白,不同的盐浓度可以得到不同的目标蛋白。这种分步洗脱的方式,适用于已知性质蛋白的分离,尤其适用于规模生产中,操作方便,易于控制。

第三种为连续的梯度洗脱,即按一定的线性变化改变洗脱液的离子强度或pH值(一般只在特殊情况下使用改变pH值的洗脱方式),在洗脱剂渐变的过程中,将不同的蛋白质逐一置换,可得到各种不同的蛋白组分,同时,蛋白质一般不拖尾。梯度洗脱是离子交换层析中最常用的洗脱方式,也是洗脱能力相对最强的洗脱方式,适合于对电荷性质相近组分的洗脱。

在洗脱过程中,顺流洗脱或逆流洗脱均可采用,顺流洗脱也称为正向洗脱,即洗脱液的流动方向与工作液的流动方向相同,逆流洗脱也称为反向洗脱,即洗脱液的流动方向与工作液的流动方向相反。若料液是自上而下正向通过交换柱进行交换吸附的,则交换柱上层吸附物的浓度要比下层高,洗脱液自下而上反向解吸可以更高效地达到洗脱的目的。但由于逆向洗脱的操作要比正向洗脱复杂得多,故目前多以正向洗脱为主。

洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离的效果,洗脱速度通常要保持恒定。一般来说,慢速洗脱的分辨率要比快速洗脱好,但洗脱速度过慢,会造成分离时间长,样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用,所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中于某个区域造成重叠,则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率。如果分辨率较好,但洗脱峰过宽,则应适当提高洗脱速度。

2.5介质的消毒:

在某些纯度要求较高的生化产品制备过程中,往往要求对分离介质进行消毒处理,以防止微生物等杂质混入目标产品中。

采用高温消毒是最常用的方法,目前大多数离子交换剂具有稳定的物理化学性能,均可进行高温消毒处理。但在使用多糖类介质时,必须注意,介质一定要处于盐型,而且要在中性条件下才能进行高温消毒处理,否则将会导致多糖大分子骨架的降解,严重影响介质的使用寿命。

NaOH也是一种很好的消毒剂,但要根据介质的耐碱程度和微生物污染的种类、污染程度选用合适浓度的NaOH。这种消毒方法也可以采用柱内浸泡法,即将一定浓度的NaOH通入柱中,关闭出液阀,浸泡几个小时后,可达到消毒的目的。NaOH如果与乙醇合用,可以得到更佳的效果。用NaOH消毒还可将消毒和在位清洗合并处理。

2.6介质的复苏

在生化分离过程中,由于分离体系较为复杂,含有多种蛋白质或其他杂质,因此在使用过程中常出现树脂的中毒现象。中毒原因可能是由于大分子的多点带电,与介质进行多点结合,致使难以洗脱,使介质的有效功能基团减少。也可能是一些较大的分子被卡牢在孔道内,难以扩散出来,堵塞了孔道,在以后的交换过程中影响到颗粒内功能基团的有效工作。除生物大分子外,色素及腐殖酸等都可使介质中毒。有时工作液中的胶状物质被粘附于介质颗粒的内外表面,覆盖了功能基团,这也是影响介质工作容量的重要因素。

由于上述原因,离子交换层析介质在使用一段时间后,可能出现颜色变深、床体收缩、分辨率下降、蛋白质收率降低、反压升高等现象。此时,需要对介质进行净化处理。对于介质用量比较大,自动化程度比较高的规模生产,应采用在原交换柱内进行,即在位清洗。先从交换柱的下面通过适量的清水,目的是去除交换柱中的悬浮物,并将床体疏松,还可以将结块的介质分散,有利于以后介质与清洗液的接触。对于一般的污染,采用逆流清洗,可减少污染物对下层介质的污染。应根据介质种类及污染程度的不同,分别选用不同种类的清洗剂及不同的清洗步骤。一般的介质是用2mol/LNaCl1mol/LNaOH0.1mol/LHCl1mol/LHCl溶液交替分阶段清洗或浸泡,各试剂交替之间须用去离子水洗至中性。若经过上述处理后仍无明显改善,尤其是流速无明显提高,则要检查交换柱布水器的纱网是否出现堵塞。

上述过程即为通常所说的复苏过程。不同的介质应选用不同的复苏方法,主要取决于介质的物理化学性能及污染物质的性质。对于多糖类的离子交换剂,每当使用一段时间后,可采用离子浓度较大的缓冲液通过交换柱或浸泡介质,因为缓冲液的离子强度较大时,有利于蛋白质大分子脱离介质,达到复苏的效果。对于物化结构稳定的介质,也可使用NaCl溶液通过交换柱或浸泡介质。对于物化结构非常稳定的介质,可用30℃~40℃的乙醇或丙酮进行洗脱或浸泡,在高温下可使吸附在介质上的蛋白变性或加快扩散速度,也有利于胶体物质的破坏,从而使污染物脱离介质。还可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl,更有利于介质的复苏。

清除沉淀蛋白、脂类、疏水性的蛋白及脂蛋白,处理步骤更为复杂。可采用100%的异丙醇、20%的乙腈、2mol/LNaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的盐酸胍、阳离子或非离子洗涤剂等作为处理液。在用过这些清洗剂后,都要用至少2倍体积的蒸馏水进行清洗。使用有机溶剂后,交换柱要采用锯齿形的梯度洗涤进行清洗,即可以在5倍床体积内,使溶剂的含量从0增至100%,然后在下一个5倍床体积中,使溶剂的含量从100%降到0

如果经过上述处理,交换柱的工作情况仍没有恢复,可以使用蛋白水解酶,将仍滞留在介质内的蛋白质进行水解,使其脱离介质。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L NaCl溶液注入到交换柱中,在室温下浸泡过夜,或在37℃下浸泡一小时。根据污染物的情况,也可以采用DNA酶等其它的酶类。无论使用哪一种酶处理后,都要重复上述清除污染物的清洗步骤,把酶清洗干净。

脂蛋白对分离介质的污染比较严重,因为脂蛋白及其它脂类物质,很容易粘附在层析柱内,最好在进行分离工艺前先将其去除。推荐使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀剂,可去除高含量的脂蛋白。

2.6介质的贮存:

各种分离介质在使用后都要进行清洗后再贮存,这对于多糖类分离介质尤为重要。分离介质在使用后,先用2个床体积的清水清洗,然后用2个床体积的20%的乙醇过柱。对于SP强酸性阳离子介质,要用含有0.2mol/L乙酸钠的20%乙醇溶液清洗,再用脱气的乙醇-水溶液以较慢的流速清洗。经过处理后,可在室温下贮存,或在4~8℃下长期存放。贮存过程中必须将层析柱全部封闭,以防止水分的挥发,造成干柱。暂时不用的介质必须贮存在20%的乙醇溶液中。所有的离子交换分离介质,都要在4℃~30℃的条件下贮存,并防止冷冻。

 
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